12. Marek's disease (MD)

Ⅰ. Introduction

• 암을 발생시키는 tumor virus.

• 암 발생을 막기 위해 백신을 개발 (백혈병의 경우 암을 막기 위해 품종을 개량)

• 닭에서 흔하고, 칠면조와 메추라기에서는 드물다.

• 전파력이 강함. 발암성. ==cell-associated==-세포를 벗어나면 바이러스가 죽어버림.

• primary target cells : spleen, bursa, thymus의 B세포

• lymphoprolifrative(림프절 증식), neuropathic(신경 침해성) 질병

• 말초 신경의 단핵구 침입(mononuclear infiltration). 홍채와 피부를 포함한 장기 또는 조직에 영향을 미침.

• 내장 림프종증, 피부 림프종증, 일시적 마비, early mortality syndrome(10일 만에 폐사^[보통 cancer는 15-16주에서 나타남]), 세포 용해성 감염, 영구적 신경 질환.

• 백신은 1970년대부터 개발, 100% 방지는 못하지만 손실을 경감시킴.

• vaccination break가 발생할 수 있다. (백신 접종을 완료했지만, 질병이 발생하는 것. 변이 바이러스 등으로 인함)

• mortality : 육계 < 산란계 (육계는 cancer가 발생하기 전 어린 나이-30일령-에 도축되기 때문)

• Visceral lymphomatosis, acute leukosis, blindness, uveitis(포도막염), iritis(홍채염), gray eye, ocular lymphomatosis 라고도 한다. (백혈병과 증상 유사, 눈 쪽에 문제 多)

Ⅱ. History

1) 역사

• 1907 : Marek - 날개와 다리에서 마비가 일어나는 case 발견
• MD와 LL의 병변이 비슷하고, 염증성인지 발암성인지 논쟁
• 1926 : tumor를 형성하는 신생물 질환
• 1950s : “visceral lymphomatosis”, “acute leukosis” 등으로 퍼짐
• 1967 : Herpesvirus에 의한 것임을 밝힘.

2) 발생

• 병원성에 따라 4가지로 분류함.

병원성	발생	특징
Mild (mMDV)	1907 ~ 1950초반	- 주로 신경 문제(마비) 발생 - tumor 발생은 적었음 - 말초 신경의 gross enlargement
Virulent (vMDV)	1950 후반 ~ 1960년대	- 조금 더 강한 병원성 - layer에서 40%, broiler에서 10%의 mortality - 신경 병변 증상도 있지만, 내장 장기의 림프종이 더 주된 증세 - “acute leukosis” or “acute MD” - Turkey herpesvirus(HVT)를 이용한 백신(JM, GA, HPRS-16)으로 예방
Very virulent (vvMDV)	1970 후반	- 더 강한 병원성 (HVT 백신으로는 잘 예방X) - 다른 종을 이용한 백신(HVT + SB-1)으로 예방됨. - 대표적인 백신 이름은 Md5
Very virulent plus (vv+MDV)	1990년대 (Korea:1996)	- (HVT + CVI988)의 조합으로 예방됨. 백신 이름은 584A.

Ⅲ. Etiology

1) Classification

• Family Herpesviridae
  • SubFamily Alphaherpesvirinae
    • Genus Mardivirus

• 3 serotypes 존재
  • 세 혈청형은 비슷하게 구성되어 백신에 serotype 2, 3 등이 사용될 수 있다.

Serotype 1	병원성 가짐 mMDV, vMDV, vvMDV, vv+MDV
	백신에 사용된 CVI988/Rispense도 속함, 병원성 없음
Serotype 2	백신에 사용됨, SB-1
Serotype 3	백신에 사용됨, HVT

2) Properties

• dsDNA, 160~180kb

  • UL이 TRL & IRL regions 옆에 있음
  • US가 TRS & IRS 옆에 있음

• Hexgonal nucleocapsid : 지름 100nm / enveloped : 140-160bm

• 병원성이 강할수록 genome size가 큰 경향을 가진다. (serotype 1 > 2 > 3)

• 유전체가 큰 편 → 단백질도 많이 encode

  • 65-68개 단백질은 인간의 HSV와 비슷, 13-26개는 MDV 고유
  • oncogenicity-related genes : 132 base pair repeats는 tumor와 관련되어 병원성 감별할 때 사용.

    • pp38 : 종양 관련 유전자 (38kd Phsphoprotein)

    • meq : 종양 관련 유전자 (Marek’s EcoQ)

  132 base pair repeats

  • virulent strain에서 few copies, attenuated strain에서 multiple copies를 갖는다.
  • serotype 1에서 oncogenic strain / attenuated strain 중 어떤 게 질병이고 어떤 게 백신인지 감별 필요 : 132bp related gene을 가지면 attenuated 안 된 것. >- 즉, band 적음 = 병원성, band 많음 = 병원성 덜함(백신주)

  • glycoprotein genes (Late genes)
    • gC gene : 세포에서 나오는 A antigen을 encode
    • gB gene : B antigen을 encode, 항체 중화(neutralizing Ab)와 관련, 호흡기 수용체 접착(추측)
    • gD gene : cell-associated 성질에 관여.
  • other genes
    • UL46, UL47, UL48, UL49 : tegument proteins를 발현 (Unique Long)
    • ICP4 : latency 관련
    • TK(thymidine kinase), Ribonucleotide reductase, DNA polymerase
    • SORF1, SORF2, SORF3

• 세포질보다는 핵에서 바이러스가 증폭 및 조립

• 안전성

  • MDV & HVT : cell-associated or cell-free
    • cell-associated : -196도 보관
    • cell-free : -70도 보관^[참고: pH3에서 10분 처리해서 불활화]
  • 일반적으로 MDV는 cell-associated virus이지만, 유일하게 FFE(feather follicle epithelium)에서 cell free virus로 존재함. (새의 깃털을 눌렀을 때 나오는 액체에 있는 바이러스는 cell-free로, 상대적으로 장기간 보관 가능.)

3) Virus replication

• initial infection : 호흡기를 통해 cell-free virus가 들어온다.
  • gB가 호흡기 receptor 접착 역할을 할 것으로 예상
• replication 속도 : 혈청형, virus strain의 단계에 따라 달라질 수 있다.
• 감염 후 cell to cell spread는 빠르지 않은 편.
• virus-cell interaction의 3가지 유형이 존재

Virus-cell interaction	특징
Productive infection	살아 있는 바이러스가 감염성을 가지고 나옴. 복제본은 1200배까지 가능. 대부분의 MDV gene은 전사되며, 전사된 vRNA가 핵과 세포질에서
i) Fully productive infection	감염력 있는 바이러스 자체가 복제되어 나옴. 외피로 감싸져 나옴. - MDV의 경우, 이 virus 형태는 FFE에서만 발견됨.
ii) Productive-restrictive infection	noneveloped 형태의 바이러스가 세포 안에 존재하면서 증식. - MDV의 주된 형태.
Latent infection	바이러스가 여전히 체내에 남아있는 경우. - protein을 더 이상 만들지 않는 nonproductive 상태 - viral genome 중에 5 copies만 존재 - ==CD4+ T cells==에 바이러스 잠복. ⇒ T cell이 억제되는 면역억제제 상황에서 선택적으로 reactivation됨. (cyclosporine, betamethasone, chicken anemia virus 등) - 일부 gene 전사 O / 번역 X
Transforming infection	cancer를 만드는 infection. - serotype 1에서만 발생. target cell은 T cell. - 5-15 copies를 포함함. 서서히 진행됨. - 종양 세포에서는 **MATSA(MD tumor-associated surface antigen)**이 발견됨.

4) Strain Classification

• 판별 : type-specific Mab, 유전자 감별(최근)
• serotype에 따라 바이러스가 잘 자라는 세포의 종류와 형성하는 plaque의 크기가 다름

혈청형	배양 세포	plaque 크기
serotype 1	DEF(duck embryo fibroblast), CKC(chickien kidney cell)	small
serotype 2	CEF	medium
serotype	CEF	large

5) Laboratory Host System

• 1일령 병아리
• Chicken embryo
• yolk : 4일령
• CAM에서 virus pocks 관찰

Ⅳ. Pathogenesis

1) Clinical signs

• 부검 관찰 : 4주령부터 tumor 관찰 가능 / 일반적으로는 12-24주령에 가능
• 잠복기는 다양함 (몇 주)
• 실제 case에서, 백신 접종하지 않은 산란계에서 3-4주에 증상 나타날 수 있으나 대부분 8-9주 또는 산란 시작 시기에 증상이 나타남.
  • molting(산란율의 회복을 위해 일정 기간 물만 주는 것) → 면역력을 떨어뜨려 마렉병 증상이 나타날 수 있음.
• 크게 4가지 form으로 분류 가능.

종류	특징
Classical form	mild MDV에서 나타남. 신경 침해가 주 증상, 다리와 날개의 마비. - neck muscle 신경 침해 → bending head 또는 torticollis - vagus nerve에 침해 → 호흡기 관련 증상
Acute form	virulent MDV에서 나타남. 내장 기관에 lymphoma 형성 - 우울, 체중 감소, 불면증, 설사 등의 증세
Acute cytolytic disease	very virulent MDV에서 나타남. 림프 기관의 위축과 함께 급성 세포 용해성 증세. - 목 주위의 thymus에서 위축이 심함 - 10-14일령에 높은 mortality를 가짐: “early mortality syndrome”
Transient paralysis (일과성 마비)	MDV의 흔하지 않은 임상 증세. 5-18주령 사이의 닭에서, 목, 날개, 다리에 다양한 정도의 마비. 감염 후 8-12일에 주로 보이며, 24-48시간 증상 지속.

2) Gross lesions

Peripheral nerve

• classical MD에 의해 주로 신경의 enlargement 발생
  • 신경이 2~3배 두꺼워지며, 외관이 변함.
  • 신경의 색깔이 yellow, gray color로 변함. (depigmentation)
• 주로 편측성으로 옴.
• sciatic and brachial nerve에 영향을 미침.

Visceral organs

• lymphomatous lesions
  • 백혈병보다 훨씬 다양한 위치에 종양 : gonad, 폐, 심장, mesentery, 신장, 간, 비장, bursa, 가슴샘, 부신, 이자, proventriculus, intestine, 홍채, 골격근, 피부
• lymphoma는 diffuse enlargement, white-grayish discoloration의 형태
• 간이 정상 형태를 벗어남
• 종양이 나타난 곳은 cauliflower-like appearance(양배추 모양 종양)
• proventriculus는 두꺼워짐, 딱딱함.
• classical MD에서는 잘 발생하지 않으며, acute MD에서는 주로 피부, feather follicle 주변, bursa of Fabricious 주변에서 종양이 나타남.
• 간과 비장의 lymphomatous enlargement는 성체에서 더 흔함.

Others

• Transient paralysis
• muscle wasting, gray eye, atrophy of the bursa or thymus 정도

3) 조직병리학적 소견

Feather follicle epithelium (깃털 모낭)

• 주요 전염 매개체
• 유일한 cell-free infectious virus (cell-free는 FFE에서 유일하게 감염성을 가짐)
• 바이러스의 복제에 따라 상피가 손상됨
  • FFE의 infection과 degeneration
  • 피부 혈관 근처 lymphoproliferative tissue의 accumulation (상피 손상)

• 골수는 MDV 감염 5일 후 감염됨, RBC count의 감소로 이어짐.
• 모체이행항체가 부족하면 marrow aplasia, marked anemia

부위	특징
Peripheral nerves	- neoplastic lymphoproliferation : T cell이 종양화, 신경에 infiltration - A-type lesions : 과증식된 T cell이 들어가서 부피 증가 (팅팅 부음) - B-type lesions : A type에 의해 부차적으로 발생. 림프구 침착에 따른 염증 반응 → 신경염성 부종(interneuritic edema)
CNS	- 혈관 주변부 림프구 침윤 → 일시적 마비 증상(transient paralysis) - perivascular cuffing
Lymphomas	- MD cells^[lymphocytes, lymphoblasts, reticulum cells, macrophages, degenerative lymphoblast]를 종양화 → 여러 세포들이 섞임, mixture 참고: Leukosis로 인한 종양은 retrovirus가 특정 세포를 종양화시키므로 단일 세포
Ocular changes	면역 관련 세포들이 눈 안쪽에 침착
Vascular syndromes	- 자주 나타나지 않음. 동맥경화 정도.

4) Factors

1. Virus strain and dose
   1. very highly
   2. highly (vvMDV)
   3. classic (vMDV)
2. Host genotype, age, sex
   • 유전과 밀접한 연관 (‘코브’라는 특정 육계 종이 잘 걸림)
   • 암수는 큰 의미 없으나, 종양 발현은 난소 > testis
3. 숙주의 면역 상태
   • 엄마의 획득 면역이 모체이행항체를 통해 후대 병아리로 이행.
   • humoral보다 cell-mediated 면역이 중요 → IBD나 CAV만큼 모체이행항체가 중요한 역할을 하지는 않음.
   • 수동 면역은 3주 정도 지속 : 4가지 기능
     • 1. acute cytolytic infection의 정도를 낮춤
     • 2. 림프구 형성을 감소 (큰 의미 없음)
     • 3. 질병 발생과 사망에 이르는 기간을 지연시킴
     • 4. mortality를 감소시킴
   • HVT의 감염, no oncogenic MDV(SB-1)의 감염 : 복제를 하긴 하는데, cytolytic infection까지는 아님. 면역 억제는 아님.
4. 스트레스
   • 산란 시기에 스트레스 관리가 잘 되면 폐사율 낮음. 반대도 마찬가지.
   • 스트레스가 매우 큰 요인

5) MD infection의 단계

Phase 1 (Early=Semi Productive-restrictive infection)

• 호흡기를 통해 림프 기관에 바이러스(cell-free) 침입.
• ==primary target cell은 spleen, bursa, thymus의 B cells.==
• 림프 기관(특히 흉선과 F낭)의 일시적 위축.
• 림프구의 apoptosis → 면역 억제가 일어남.
• 이후 latent infection으로 넘어감.

Phase 2 (latent infection)

• activated CD4+ T cell이 가장 영향 받음.

Phase 3 (Second Phase of Cytolytic Infection)

• second wave로 면역 억제가 더 심해짐
• vvMD 또는 vv+MD에서 두 번째 cytolytic infection이 나타나기도 함.
• pathotype이 높은 바이러스에 감염되었거나, 숙주가 감수성이 높은 종이거나.

Fully productive infection (=Cytolytic Infection)

• 감염된 림프구를 통해 FFE로 이동
• 그 자체로, 세포와 관계없이(cell-free) 감염성을 가지는 바이러스를 생산한다.

Phase 4 (Development of Lymphomas)

• 림프구가 특정 장기에 과증식하면서 종양을 형성
• lymphoma가 나타나면 3-4주 안에 폐사
• lymphoma transformation의 조건 (중요X)
  • lasting T cell은 나타나지 않고, activation된 T cell만 나타남

Ⅴ. Epizootiology

• 닭과 동물에 주로 감염됨.

• 어느 일령에나 감염될 수 있지만, 초기 몇 주간 대부분 감염 발생

• 4도에서는 수년간, 20-25도에서도 수 개월

• vertical transmission은 일어나지 않음

• Horizontal spread : 바이러스가 묻은 dander, litter 같은 지저분한 물체들

Ⅵ. Diagnosis, Prevention

• 마렉 진단 어려움. LL과 종양 양상 비슷.
• 하지만 임상에서 종양을 만났다? 마렉으로 봐도 거의 틀리지 않음..

1) 임상 증상, 부검 소견

• dehydration, starvation에 의해 폐사
• 말초신경의 enlargement
• (MD이든 LL이든 어디든 tumor가 나타날 수 있다)
• MATSA 존재 여부 확인 (시약 이용)
• lymphoid leukosis가 가장 흔한 감별 진단

2) Isolation & Identification

• Buffy coat cell
• cell culture 시스템을 가장 많이 쓴다
  • serotype 1 : DEF(duck embryo fibroblast)나 CKC(chicken kidney cell)에서 잘 자람
  • serotype 2&3 : CEF(chicken embryo fibroblast)
• FFE 끝에 고여 있는 액체에서 균 검출
• 1일령에 백신 접종 시 증상이 나오는지 안 나오는지 확인
• serotype 1 중 oncogenic strain / attenuated strain 중 어떤 게 질병이고 어떤 게 백신인지 감별 필요 : 132bp related gene을 가지면 attenuated 안 된 것.

3) Vaccination

• 1일령에 접종하면 전 생애 면역
• serotype 1
• serotype 2 : SB-1
• serotype 3 : HVT
• polyvalent : HVT+SB-1
• recombinant vaccine (serotype 1+3)^[Herpes는 크기가 크다-nonessential region이 많음. HVT 유전자에 VP2를 집어넣으면 VP2 protein도 발현한다. 그럼 항체를 만들게 된다. 그럼 VP2 단백질에 대한 항체가 있으니 IBD도 면역됨. 즉, 한 백신으로 Marek도, IBD도 막는 것. 이런 식으로 계속 욱여넣다 보면 여러 바이러스에 대한 항체가 떨어지지 않고 상승. 굉장히 많이 사용되고 있음.]